مروری بر روش های نوظهورآزمایش سریع کووید-19

منبع: نیچر بیوتکنولوژی: ۲۳ مارچ ۲۰۲۰

موفقیت خارق العاده سنگاپور ، تایوان و هنگ کنگ در محدود کردن تأثیر سندرم حاد تنفسی ناگهانی کروناویروس -۲ (SARS-CoV-2) نشان می دهد که می توان با یک سرمایه گذاری عمده در آمادگی همه گیری ، پاسخی مؤثر به شیوع آن داد. با وجود نزدیکی به چین ، این سه منطقه موفق شده اند تعداد پرونده ها و تلفات را کم نگه دارند. آنها با آموختن از شیوع کروناویروس قبلی که این سرزمین ها دارای آن بودند ، توانستند به سرعت روش های آزمایش انبوه را مستقر کنند ، آن را با نظارت دیجیتالی ترکیب کنند تا حرکات افراد را ردیابی کنند و در موارد مشکوک علاوه بر ساخت انبارهای بزرگ تجهیزات محافظت شخصی ، قرنطینه های سخت را نیز در موارد مشکوک تحمیل کنند.

در بقیه نقاط جهان ، بیشتر کشورها برای حمله ویروس کاملاً آماده نبودند. در نتیجه ، بسیاری از سیستم های مراقبت های بهداشتی قبل از انجام آزمایشات کافی تا امکان ایزولاسیون و ردیابی را فراهم کنند با انتقال فرد به فرد در جامعه روبرو شده اند . با توجه به رویه معمولا غیرقابل انعطاف مقامات بهداشت عمومی ، بسیاری از آنها در اعتبارسنجی ، اجرا و توزیع آزمایش های تشخیصی SARS-CoV-2 و و بخصوص آزمایشات سریع غیر متمرکز که در محل مراجعه بیمار قابل انجام باشد ( POC ) غافلگیر شده اند. در حال حاضر با اولین محموله های چنین آزمایش هایی ، آن تصویر در حال تغییر است. از این گذشته ، بحران کنونی می تواند یک لحظه تعیین کننده برای تشخیص مبتنی بر فناوری CRISPR باشد – اولین آزمایش تشخیصی مبتنی بر فناوری ویرایش ژن CRISPR ممکن است ظرف چند هفته در دسترس قرار گیرد. با این حال ، برای متوقف کردن انتشار ویروس ، تلاش گسترده ای صورت می گیرد تا تولید آزمایش های POC با کاربرد آسان و سپس استقرار گسترده آنها انجام شود.

تاکنون پاسخ خط مقدم به شیوع SARS-CoV-2 آزمایش واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بوده است. PCR تست انتخابی برای تشخیص یک عامل عفونی است و این مزیت را دارد کهچرایمرهای مورد نیاز برای انجام چنین آزمایشاتی به محض شناخت توالی ویروسی می توانند با سرعت نسبتا مناسبی تولید شوند. اولین آزمایش های کمی مبتنی بر RT-PCR برای تشخیص SARS-CoV2 ، با فاصله کمی بعد پس از شناسایی ویروس در ماه ژانویه توسط سازمان بهداشت جهانی (WHO) طراحی و توزیع شد ،. پروتکل انجام این آزمایش پیچیده و گران است ، و به طور عمده برای آزمایشگاههای تشخیصی متمرکزو بزرگ است. آزمایشها بطور معمول ۴-۶ ساعت طول می کشد ، اما نیاز لجستیکی برای ارسال نمونه های بالینی به این معنی است که زمان آماده شدن پاسخ در بهترین حالت ۲۴ ساعت است. در ایالات متحده ، مرکز کنترل بیماریهای آمریکا تصمیم گرفت آزمایش خود را بجای آزمایش آزمایش WHO انجام دهد. تاخیرها و دخالت های سازمان غذا و داروی ایالات متحده در مجوزبه آزمایشگاه های بهداشت عمومی یا بیمارستان برای انجام آزمایشات ، ایراد یکی از محلوهای مورد استفاده در آزمایش اولیه RT-PCR که در اوایل فوریه توسط مرکز کنترل بیماریها تهیه و توزیع شده بود ، و کمبود مواد مورد نیازبرای استخراج RNA باعث افزایش تاخیر در ارائه آزمایش آزمایشات در سطح کشورآمریکا گردید.

با وجود این کاستی ها ، Multiplex RT-PCR ، که در آن امکان آزمایش چندین توالی هدف به طور همزمان وجود دارد، به عنوان ستون اصلی آزمایش ، بویژه در آزمایشگاه های متمرکز ، باقی خواهد ماند. ارائه دهندگان بزرگی مانند Roche Diagnostics ، Thermo Fisher Scientific ، Qiagen و Quest Diagnostics با امکان اتوماسیون خدمات تست SARS-CoV-2 ، ظرفیت انجام چنین آزمایش هایی را افزایش داده اند.

برای تسریع در تصمیم گیری های بالینی و کم کردن بخشی از حجم کار از آزمایشگاه های تست متمرکز ، آزمایش های POC نیز لازم است. تست های سریع POC برای استفاده در سطح جامعه توسط یک گروه متخصص WHO که ماه گذشته در ژنو برگزار شد ،دررتبه نخست از هشت اولویت تحقیقاتی قرار گرفت. بنیاد تست های تشخیصی جدید نوآورانه (FIND) ، که یک موسسه غیر انتفاعی مستقر در ژنو است و در زمینه پشتیبانی و راه اندازی و تحویل روش های تشخیصی به کشورهای کم درآمد فعالیت دارد تلاش گسترده ای با دعوت از توسعه دهندگان روش های جدید برای ارائه محصولات خود برای ارزیابی مستقل انجام داده است. تا این زمان بیش از ۲۲۰ مورد برای ارزیابی ارسال شده است و تا پایان این ماه با تولید کنندگان واجد شرایط تماس گرفته می شود. FIND همچنین لیستی گسترده از ارائه کنندگان کیت های تشخیصی SARS-CoV-2 را گردآوری کرده است ، که عمدتا شرکتهایی هستند که آزمایشات تشخیص اسید نوکلئیک مبتنی بر PCR یا ایمنی سنجی انجام می دهند. از طرفی، دانشکده بهداشت عمومی Saw Swee Hock در دانشگاه ملی سنگاپور از نزدیک در حال پیگیری تحولات در امور تشخیصی چه در شرکت های تجاری و چه در آزمایشگاه های دانشگاهی است.

ایمونو اسی ها می توانند اطلاعات در مورد سابقه قرار گرفتن در معرض ویروس ، و همچنین شواهد تشخیصی ارائه دهند. این روش ها از شناسایی آنتی بادی و آنتی ژن استفاده می کنند ، این اقدام از طریق استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال (mAbs) برای تشخیص آنتی ژن های ویروسی در نمونه های بالینی ویا با استفاده از آنتی ژن های ویروس کلون شده برای تشخیص آنتی بادی های بیمار در مقابل ویروس صورت می گیرد.lateral flow assay format (فرمت سنجش جریان جانبی) – در واقع یک نوار قرا گرفته در یک کاست است که حاوی معرفهای جذب (که یا یک mAb برای آنتی ژن ویروسی است و یا یک آنتی ژن ویروسی است که توسط آنتی بادی های بیماران تشخیص داده می شود) و mAbs شناساگر همان هدف در مناطق مشخص شده بر روی غشای نیتروسلولوزی چسبانده شده اند. با اتصال بین آنالیت و mAb نتیجه مثبت می شود و به عنوان یک خط رنگی قابل مشاهده است. دو قطره خون از نوک انگشت برای تشخیص ویروس کافی است. آنها در اصل مشابه کیت های تست حاملگی خانگی هستند.

با این حال ، نه PCR و نه فناوری های ایمنی سنجی ایده آل نیستند. تستهای PCR بسیار دقیق بوده و با سرعت قابلراه اندازی هستند اما نحوه استفاده از آنها پیچیده و زمانپاسخدهی طولانیست. روش های ایمنی سنجی از دقت کمتری برخوردار هستند و برای راه اندازی زمان بیشتری وقت لازم است اما استفاده از آنها بسیار آسان است و نتایج در طی ۲۰ تا ۶۰ دقیقه قابل دسترسی می باشد و از آنجا که این شیوه های ایمونو اسی آنتی بادی های بیمار را در برابر یک پاتوژن یک بیماری زا ردیابی می کنند ، اینها به ناچار باید با تنوع ذاتی پاسخ آنتی بادی پلی کلونال انسان نیز روبرو شوند. Ranga Sampath ، رئیس ارشد علمی FIND می گوید: ” پاسخ آنتی بادی برای توصیف به زمان نیاز دارد.” بنابراین نتایج بدست آمده در طی آزمایش اعتبار سنجی ، لزوماً در تنظیمات بالینی ممکن است تکرار نشود. در نتیجه این آزمایش ها قطعی نیستند و این بزرگترین چالش با روش های ایمونو اسی است.”

با این وجود سرعت و تطبیق پذیری ایمونواسی ها باعث می شود تا آنها آزمایش های ارزشمندی باشند. و تلاش برای تولید آنها در مقیاس گسترده شروع به افزایش می کند. An-Suei Yang ، پژوهشگر مرکز تحقیقات ژنومیک ، Academia Sinica ، در تایپه ، تایوان ، و همکارانش ادعا می کند که برای نخستین بار موفق به تولید پروتئین mAb در برابر پروتئین نوکلئوکپسید (N) از SARS-CoV-2 ، که می تواند پایه و اساس آزمایش سریع آنتی ژن باشد. آن ها همچنین آنتی بادی هایی شناسایی پروتئین SARS-CoV-2 و پروتئین های اصلی SARS-CoV N یا پروتئین SARS-CoV N را هم تولید کرده اند. هیچ یک از این mAbs ها با پروتئین نوکلئوکپسید سایر سویه های کوروویروس انسانی متصل نمی شود. وی گفت: “اگر این محصولات با موفقیت تولید و تأیید شود ، کیت تست ایمنی مبتنی بر ایمنی می تواند آنتی ژن کرونا ویروس را تنها در ۲۰ دقیقه بدون ابزار دقیق و پرسنل آموزش دیده ، با هزینه و تاثیر تست سریع آنفلوانزا LFIA [ایمنی سنجی جریان جانبی] تشخیص دهد.” گروه یانگ با کار با مدل های هوش مصنوعی از فعل و انفعالات آنتی بادی و آنتی ژن ، که آنها برای تولید کتابخانه های آنتی بادی مصنوعی استفاده می کردند ، تنها ۱۹ روز این کار ارزشمن را انجام داده اند.. DNA آنتی بادی های پیش بینی شده می تواند از نظر شیمیایی سنتز شود و mAbs حاصله می تواند در سیستم های نمایش فاژ در باکتریها بیان شود. با اجتناب از ایمن سازی حیوانات برای به دست آوردن آنتی بادی های مونوکلونال ، حدود دو ماه از چارچوب زمانی معمول صرفه جویی می شود. این گروه اکنون در حال کار بر روی یک نمونه اولیه LFIA است ،و در نظر دارد مجوز پنل آنتی بادی را برای شرکت های ثالث نیزصادر کند.

سونا نانوتک مستقر در Halifax ، Nova Scotia با همکاری GE دامنه S1 پروتئین SARS-CoV-2 را به عنوان هدف LFIAانتخاب کرده است . پروتئین (S) با اتصال به آنزیم ۲ آنژیوتانسین ۲ (ACE2) بیان شده بر روی سطح سلولهای اپیتلیال مجاری هوایی ورود ویروس به سلول را تسهیل می کند. دارن روولز ، مدیر عامل شرکت می گوید: “ما پیش بینی می کنیم در شش تا هشت هفته آینده محصولی که فقط استفاده تحقیقاتی دارد را در دسترس قرار دهیم فراتر از این ، این شرکت همچنین در نظر دارد یک محصول دوگانه را برای فصل بعدی آنفلوانزای نیمکره شمالیتولید کند می تواند تشخیص SARS-CoV-2 و ویروس آنفلوانزا را در یک آزمایش واحد ترکیب کند.

آزمایشات تشخیص آنتی بادی های پلی کلونال بر علیه SARS-CoV-2 در بیماران سریعتر از آزمایش هایی که برای تشخیص خود ویروس انجام می شود راه اندازی می شوند، زیرا که آنها فقط بر علیه آنتی ژن نوترکیب ویروس طراحی شده و بکار برده می شوند (که تولید آن بسیار آسان تر از mAbs در برابر ویروس است). آنها همچنین در مقایسه با تست های مبتنی بر mAb میزان مشابهی از دقت دارند.

Pharmact مستقر در برلین در حال حاضر ارسال تست های ایمونو اسی ۲۰ دقیقه ای حاوی سه آنتی ژن ( پروتئین N و حوزه S1 و S2 پروتئین S. )(SARS-CoV-2 را آغاز کرده است:. این تست به گونه ای طراحی شده است تا هر آنتی بادی بیمار را که این ساختارهای پروتئین را تشخیص دهد تشخیص دهد .هدف آن ها این است که تا ماه آوریل است یک میلیون تست تولید کنند. هر دو آنتی بادی ایمونوگلوبولین (Ig) M و IgG را که به ترتیب در مراحل اولیه و بعد از عفونت آزاد می شوند ، توسط این تست قابل تشخیص خواهند بود. این شرکت در یک بررسی برای اعتبار سنجی این تست آن را با PCR مقایسه کرده است و از نمونه هایی از ۱۱۴ بیمار آلوده و ۱۲۶ فردغیر آلوده به عنوان کنترل استفاده کرده است. در این بررسی میزان اختصاصیت تست صد در صد اعلام شده است. و میزان مثبت کاذب نیز صفر در صد بوده است. اما حساسیت آن کمتر بوده است. ئلیل این موضوع آن است که پاسخ IgM در مراحل اولیه عفونت (روزهای ۴ تا ۱۰) قوی نیست. به نحوی که مؤلفه IgM فقط ۷۰٪ حساسیت را نشان می دهد. این میزان بین روزهای ۱۱ و ۲۴ به سرعت به ۹۲٫۳ درصد می رسد ، و جزء IgG آزمایش در این مرحله از عفونت حساسیت ۹۸٫۶ درصد را نشان می دهد. بورگارد می گوید ، به طور کلی ، این تست دارای ۱۳ درصد منفی کاذب است.

ترکیب روش های آزمایش غیر متمرکز با شیوه های مراقبتی اپیدمیولوژیک جایگاه دست اندرکاران نظام سلامت را در مبارزه با همه گیریSARS-CoV-2 را تقویت می کند.

مطالعه آنفولانزا سیاتل که توسط دانشگاه واشنگتن رهبری می‌شود در بحران فعلی یک شیوه نوآورانه یک شیوه رویکرد نوآورانه را اتخاذ کرده است در این مطالعه شرکت کنندگانی که علائم تنفسی دارند می توانند به صورت آنلاین یک کیت سواب بینی درخواست کنند که توسط پست برای آنها ارسال می گردد. جمع آوری اطلاعات رضایت نامه و اقدامات امشابه از طریق الکترونیکی صورت می گیرد اما این روش همچنان وابسته به شیوه های آزمایشگاه های مرکزی است وو بر اساس روش های غیر متمرکز نیست . در فنلاند یک مطالعه نشان داد که این امکان وجود دارد که به صورت زنده داده های اپیدمیولوژیکی از طریق ترکیب اتوماتیک روش های تست های غیر متمرکز در سیستم داده های آزمایشگاهی انجام گیرد. سیستم POC ، mariPOC Respi ، توسعه یافته توسط Turku ، ArcDia مستقر در فنلاند این داده ها را به کلاود منتقل می کند. این شیوه در حال حاضر ۱۱ پاتوژن دستگاه تنفسی شامل ۱۰ ویروس و یک باکتری را در بر می گیرد.

. این شرکت در حال حاضر قصد دارد SARS-CoV-2 در طی چند ماه به این مجموعه اضافه کند. این سیستم برای تعداد انبوه همزمان طراحی نشده است بلکه بر روی یک دستگاه آنالایزر بنچ تاپ طراحی شده که می تواند روزانه در حدود ۱۰۰ نمونه را بررسی کند اما هزینه مواد مصرفی آن در حدود یک سوم پی سی آر میباشد. این سیستم برای کلینیکهای محلات مانند مراکز بهداشتی اولیه بزرگ طراحی شده است. هر چند که این شرکت ۵۰ درصد سهم بازار را در فنلاند دارد در سایر کشورها سهمیه چندانی ندارد چراکه آزمایشگاه های بزرگ سیستم مولتی پلکس پی سی آر را ترجیح می دهند. به گفته رییس mariPOC Respi مسئولین اینگونه آزمایشگاه ها رهبران تصمیم‌گیر در سیستم های تشخیصی هستند و در تقسیم قدرت با آزمایشات غیرمتمرکز اکراه دارند. به گفته مسئول این شرکت این یک اختلال ساختاری است.

Scanwell Health در تلاش است یک آزمایش حتی غیرمتمرکز تر را اجرا کند – یک روش ایمونو اسی خانگی و یک اپلیکیشن تلفن همراه ، که به کاربر امکان می دهد تا نتیجه را با پزشک یا پزشک پرستار به اشتراک بگذارد.

شرلوک بیوشینس نیز در حال انجام چندین طرح SARS-CoV-2 است. Rahul Dhanda ، مدیرعامل و بنیانگذار شرلوک می گوید: “این یک فن آوری به سرعت مستقرمی شود.” این شرکت قصد دارد با Cepheid برای ایجاد آزمایشهای مبتنی بر CRISPR برای طیف وسیعی از بیماریهای عفونی از جمله COVID-19 همکاری کند.با توجه به ضرورت بحران کنونی ، شرلوک همچنین در حال تحقیق است که آیا می تواند در یک بازه زمانی کوتاه تر یک آزمایش ساده تر را به بازار عرضه کند. Dhanda می گوید: “ما با تولید کنندگان کیت در این زمینه همکاری می کنیم.

با توجه به عدم قطعیت های مربوط به مسیر اپیدمی فعلی ، مشخص نیست که آیا فناوری CRISPR سهم عمده ای در تلاش های جهانی برای پیگیری پیشرفت SARS-CoV-2 خواهد داشت یا خیر. اما نیاز به چنین فناوری ضروری به نظر می رسد. مارتین می گوید: “این مساله شکاف بزرگی را در بازار تشخیص مولکولی ایجاد کرده است.” این تنها یکی از شکاف های متعدد در سطح آمادگی اکثر کشورها برای همه گیری ویروسی است.

لیست منتخب آزمایشات تجاری شده برای SARS-COV-2

شرکت	آزمایش	توضیحات	وضعیت
Guangzhou Wondfo Biotech (Guangzhou, China)	Wondfo SARS-CoV-2 antibody test	Lateral flow 15-minute immunoassay that detects IgM and IgG antibodies directed against SARS-CoV-2	National Medical Products Administration EUA in China; CE mark in Europe
Innovita Biological Technology	SARS-CoV-2 antibody assay	Lateral flow 15-minute immunoassay that detects IgM and IgG antibodies directed against SARS-CoV-2	National Medical Products Administration EUA in China
Jiangsu Medomics Medical Technologies (Nanjing, China)	SARS-CoV-2 rapid combined IgM/IgG antibody test kit	Lateral flow 15-minute immunoassay that detects IgM and IgG antibodies directed against SARS-CoV-2	Shipping
Mammoth Biosciences	SARS-CoV-2 DETECTR	۳۰-minute lateral flow assay	In validation studies
Pharmact (Berlin)	SARS-COV-2 Rapid Test	POC 20-minute test for detecting SARS-CoV-2 exposure through identification of IgG and IgM antibodies	CE-marked and shipping
Snibe Diagnostic (Shenzhen, China)	MAGLUMI 2019-nCoV IgM/IgG kit	Automated central laboratory rapid test that runs on MAGLUMI chemiluminescence immunoassay system	CE mark received 19 February 2020
Sona Nanotech (Halifax, Nova Scotia)	Rapid SARS-CoV-2 antigen detection test	Lateral flow screening test for S1 domain of SARS-CoV-2 S1 protein	Assay development and testing with GE Healthcare Life Sciences underway
Sherlock Biosciences, Cepheid	Rapid CRISPR-based tests for SARS-CoV-2 and other pathogens	Combines SHERLOCK Cas12 and Cas13 enzymes for nucleic acid detection with Cepheid’s GeneXpert test-processing instruments	Intended as proof of concept for a broad product development alliance in infectious disease
Zhejiang Orient Gene Biotech (Zhejiang, China)	COVID-19 IgG/IgM Rapid Test	Solid-phase immunochromatographic assay	Aytu Bioscience has sublicensed US distribution rights from L.B. Resources (Hong Kong) and plans to obtain EUA; already has CE mark
Biomerica	Rapid POC IgM/IgG antibody test	$۱۰ lateral flow immunoassay	Commenced shipping samples; seeking FDA EUA approval
Caspr Biotech	Ultrasensitive, rapid, and portable coronavirus SARS-CoV-2 sequence detection	Based on CRISPR-Cas12	Proof of principle evaluation
Sugentech (Daejeon, South Korea)	SGTi-flex COVID-19 IgM/IgG	Ten-minute lateral flow immunoassay that detects IgM and IgG antibodies directed against SARS-CoV-2	CE Mark
Cepheid	Xpert Xpress SARS-CoV-2	Rapid PCR test that runs on GenXpert benchtop system – delivers result in two hours from sample collection to delivery of result	Received FDA emergency use authorization
Xiamen AmonMed Biotechnology (Fujian, China),	COVID-19 IgM/IgG test kit (Colloidal gold)	Ten-minute lateral flow immunoassay that detects IgM and IgG antibodies directed against SARS-CoV-2	CE Mark